Gelelektrophorese Mindmap

Das Thema verstehen

Die Gelelektrophorese ist ein Laborverfahren zur Trennung von DNA-, RNA- oder Proteinfragmenten nach Größe und Ladung. Im elektrischen Feld wandern die geladenen Moleküle durch ein Agarose- oder Polyacrylamidgel; kleinere Fragmente bewegen sich schneller als größere. Die Methode ist Grundlage vieler Anwendungen wie DNA-Fingerprinting, PCR-Kontrolle und Proteinanalyse und gehört zu den zentralen Techniken der Molekularbiologie.

Warum wandern DNA-Fragmente unterschiedlich schnell?
DNA-Moleküle tragen durch ihre Phosphatgruppen bei neutralem pH eine gleichmäßige negative Ladung, sodass die Ladung pro Längeneinheit nahezu konstant ist. Die Trennung im Gel beruht daher nicht auf unterschiedlicher Ladung, sondern auf der Größe: Die Gelmatrix bildet ein Netzwerk aus Poren, durch das kleine Fragmente leicht hindurchschlüpfen, während große Fragmente häufiger behindert werden. Bei Agarosegeln lässt sich die Porengröße über die Agarosekonzentration einstellen; hohe Konzentrationen eignen sich für kleine Fragmente, niedrige für große. Sehr große Moleküle können das Gel kaum durchdringen, weshalb für sie alternative Verfahren wie Pulsfeldgele nötig sind.

Agarose versus Polyacrylamid
Agarosegele werden vor allem für DNA und RNA verwendet, weil sie große Poren besitzen und sich leicht gießen und handhaben lassen. Polyacrylamidgele haben deutlich kleinere Poren und trennen Proteine oder kurze DNA-Stücke mit höherer Auflösung. Bei der Protein-Gelelektrophorese wird meist SDS-PAGE eingesetzt: Das Detergens SDS denaturiert die Proteine und überzieht sie mit negativer Ladung, sodass die Wanderung vor allem von der Molekülmasse abhängt. Für die native Trennung unveränderter Proteine wird dagegen auf SDS verzichtet, wobei dann auch die Eigenladung und die Faltung des Proteins die Wanderung beeinflussen.

Ablauf eines typischen Gel-Laufs
Zunächst wird das Gel geschmolzen, in eine Gießform gegossen und mit Kammern für die Taschen versehen. Nach dem Erstarren kommen die Proben, vermischt mit Ladungsmarker und Dichtegeber, in die Taschen. Der Größenstandard läuft in einer eigenen Bahn mit. Unter angelegter Spannung wandern die Moleküle vom Minuspol zum Pluspol; der Ladungsmarker zeigt das Laufende an, damit die Proben nicht aus dem Gel herauslaufen. Anschließend wird das Gel gefärbt und unter geeigneter Beleuchtung abgebildet. Die Bandenpositionen werden dann mit dem Standard verglichen, um die Fragmentgrößen abzuschätzen.

Anwendungen und Grenzen
In der Forensik und Vaterschaftsanalyse ermöglicht die Gelelektrophorese den Vergleich von DNA-Profilen, wobei heute meist kapillare Systeme statt klassischer Gele verwendet werden. In Forschung und Praktikum dient sie der Kontrolle, ob eine PCR das erwartete Produkt geliefert hat, oder ob ein Restriktionsverdau erfolgreich war. Wichtig ist die Grenze der Aussagekraft: Ein Bande zeigt nur, dass Fragmente einer bestimmten Größe vorhanden sind, nicht deren Sequenz. Auch ähnlich große Fragmente können sich überlagern. Für eine sichere Identifikation sind daher zusätzliche Verfahren wie Sequenzierung oder Blotting erforderlich.