reazione a catena della polimerasi mappa concettuale

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La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare che amplifica in vitro specifici segmenti di DNA. Ideata da Kary Mullis negli anni Ottanta, si basa su cicli ripetuti di denaturazione, appaiamento dei primer ed estensione da parte di un DNA polimerasi termostabile. La PCR è oggi fondamentale in genetica, microbiologia, diagnostica e medicina legale, con varianti come la qPCR e la RT-PCR.

Come funziona il ciclo termico
Ogni ciclo di PCR si articola in tre passaggi controllati termicamente. Nella denaturazione, intorno ai 94-95 °C, il doppio filamento di DNA si separa in singoli filamenti. Nella fase di appaiamento (annealing), la temperatura scende tipicamente tra 50 e 65 °C: i primer, brevi oligonucleotidi progettati sul target, si legano alle sequenze complementari. Nell'estensione, a circa 72 °C, la DNA polimerasi sintetizza il nuovo filamento partendo dai primer. Ripetendo questi passaggi per decine di cicli, il numero di copie cresce in modo esponenziale, almeno fino a quando reagenti ed enzima restano efficienti.

Il ruolo della Taq polimerasi
Le prime PCR usavano polimerasi che si denaturavano al calore e andavano aggiunte a ogni ciclo. La svolta arrivò con l'impiego di enzimi termostabili isolati da batteri termofili, come la Taq polimerasi di Thermus aquaticus. Questi enzimi sopravvivono alla denaturazione e permettono l'automazione della reazione nei termociclatori. La Taq, però, non possiede attività di correzione di prove letture (proofreading), quindi può introdurre errori: per applicazioni che richiedono alta fedeltà si usano polimerasi con attività 3'-5' esonucleasica, derivate da altri termofili.

PCR e RT-PCR: una distinzione importante
La PCR classica amplifica DNA. Per analizzare RNA, come il genoma di alcuni virus, serve prima una trascrittasi inversa che converte l'RNA in DNA complementare (cDNA): si parla allora di RT-PCR, dove RT sta per reverse transcription. Da non confondere con la qPCR, che quantifica l'amplificazione in tempo reale misurando la fluorescenza a ogni ciclo. Nella diagnostica molecolare le due tecniche si combinano spesso: una RT-PCR quantitativa in tempo reale rileva e misura simultaneamente il materiale genetico di un patogeno in un campione clinico.

Contaminazione e buone pratiche
Poiché la PCR amplifica anche quantità minime di DNA, è molto sensibile alla contaminazione: pochi frammenti estranei possono generare un falso positivo. Per questo i laboratori separano fisicamente le aree di preparazione dei campioni e di allestimento delle reazioni, usano puntali con filtro e includono controlli negativi, che non devono amplificare, e controlli positivi, che devono funzionare. Anche la specificità dei primer è cruciale: primer mal progettati possono legarsi a sequenze non desiderate, producendo prodotti aspecifici che complicano l'interpretazione dei risultati.